Bulletin d'information en santé environnementale

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Évaluation quantitative des adduits à l’ADN dans des cellules endobuccales par immunofluorescence et de la mutagénicité urinaire par le test d’Ames

Deux tests biologiques pour mesurer l’exposition professionnelle aux HAP

A. Nikoyan, M. DeMeo, I. Sari-Minodier, C. De Giorgio, A. Botta, Laboratoire de Biogénotoxicologie et Mutagenèse Environnementale, facultés de Médecine et de Pharmacie, France

Introduction

Différents secteurs industriels dans lesquels l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) est importante, comme les fonderies, les cokeries, l’industrie de production de l’aluminium, font partie des activités classées cancérogènes pour l’homme par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC).

De nombreux travaux portant sur le risque génotoxique de populations exposées ont été réalisés dans ces secteurs d’activité professionnelle. Cependant, ces études concernent des situations très différentes pour les niveaux d’exposition, les multi-expositions aux HAP et les co-expositions avec d’autres produits (cokeries, fonderies, industrie de l’aluminium). Les biomarqueurs étudiés sont généralement assez variés : métabolites urinaires (1-hydroxypyrène: 1-OHP, 3-hydroxybenzo[ a]pyrène : 3-OHBaP), adduits détectés par post-marquage, adduits spécifiques benzo[a]pyrène-(trans)-7,8-dihydrodiol-9,10-époxide (BPDE), anomalies chromosomiques, échanges de chromatides soeurs, micronoyaux. Enfin, différents polymorphismes de gènes impliqués dans le métabolisme des HAP sont étudiés, notamment le cytochrome P450 1A1 et la glutathion S- transférase (Pavanello et Clonfero, 2000).

Le but de ce présent travail a consisté à caractériser l’exposition professionnelle aux HAP d’une population de 12 salariés, par deux biomarqueurs d’exposition :

  • la mutagénicité urinaire avec les souches S. typhimurium TA98 en présence de la fraction métabolique (S9 Mix) et YG1041 en présence comme en absence de S9 Mix pendant un suivi de deux jours;
  • le taux d’adduits benzo[a]pyrènediolépoxyde- ADN (BPDE-ADN) évalué par immunofluorescence dans les cellules endobuccales.

Les résultats obtenus ont été comparés avec les taux atmosphériques de pyrène (Pyr) et de benzo[a]- pyrène (BaP), et avec les concentrations urinaires de 1-OHP et 3- OHBaP.

Matériels et méthodes

Sujets

La population étudiée s’est composée de 12 salariés (n° 63-75) de la cokerie d’une usine sidérurgique, soumis à des méthodes de protection variées (individuelles et générales) et d’un volontaire sain (n° 62) qui a séjourné pendant deux jours consécutifs (2x7h) sur l’emplacement de la cokerie. Une étude de cinétique de 48 heures a été réalisée avec tous les biomarqueurs d’exposition aux HAP : le Pyr et le BaP atmosphériques, le 1-OHP et le 3- OHBaP urinaires et la mutagénicité urinaire.

Détermination des concentrations atmosphériques de BaP et de Pyr

Les HAP atmosphériques ont été collectés par l’intermédiaire de pompes individuelles équipées de filtres PALLFLEX T60 A20 durant deux périodes de travail consécutives de 7 heures. Les dosages des HAP ont été effectués par HPLC/ FD par l’INRS (Institut National de Recherche et Sécurité, Vandoeuvre, France). Les extractions des composés ont été effectuées par Soxhlet dans un mélange de dichlorométhane : acétonitrile (5:1). Une purification sur colonne d’alumine a permis d’éliminer les alcanes (Lafontaine et al., 2000).

Dosage du 1-OHPyr et du 3- OHBaP urinaires

L’exposition aux HAP peut être directement évaluée par les dosages urinaires du 1-OHP et du 3-OHBaP, les métabolites du Pyr et du BaP. Les concentrations de 1-OHP et de 3-OHBaP ont été déterminées selon les techniques modifiées de Simon et al. (2000) et Gendre et al. (2002). Ces mesures ont été effectuées par l’INRS.

Test d’Ames

L’extraction et la concentration des mutagènes urinaires ont été effectuées sur résine Amberlite XAD-2 (Yamasaki et Ames, 1977). La concentration finale des résidus dans le DMSO était de x250. Au cours de cette étude, nous avons utilisé une microméthode du test d’Ames (De Méo et al., 1996) sur une batterie de souches de Salmonella typhimurium : TA98 avec activation métabolique S9 Mix (TA98S) et YG1041 avec et sans S9 Mix (YG1041S et YG1041, Nikoyan et al., 2007).

Détection des adduits BPDE-ADN par immunofluorescence

Les adduits à l’ADN d’un des métabolites du BaP, le benzo[a]pyrène-(trans)-7,8- dihydrodiol-9,10-époxide (BPDE) (Santella et al., 1999) ont été mesurés dans les cellules endobuccales de 6 salariés (nos 70 à 75) en début et en fin de poste de travail (DP et FP) pendant deux jours consécutifs. Nous avons employé une technique d’immunocytochimie (Romano et al., 1999) utilisant l’anticorps monoclonal 5D11 (Trevigen, France) dilué au 1 :100 dans du sérum foetal bovin, puis l’anticorps secondaire anti IgG de souris marqué au Cy3 (cyanine, Tebu International, France).

Résultats

Mesures atmosphériques de Pyr et BaP

Les mesures atmosphériques d’exposition pour chaque sujet se sont limitées au Pyr et BaP sur deux jours consécutifs. Les valeurs sont comprises entre 97,0 et 176 000,0 ng/m3 pour le Pyr (médiane : 3 100,0 ng/m3), et entre 11,0 et 98 100,0 ng/m3 pour le BaP (médiane : 1 070,0 ng/m3). À l’exception des individus nos 63 et 66, les concentrations de BaP mesurées sont largement au-dessus de la valeur limite d’exposition (VLE : 150 ng/m3), ce qui souligne une forte exposition aux HAP durant ces deux jours de travail.

Métabolites urinaires 1-OHP et 3-OHBaP

La figure 1A représente la courbe de cinétique d’excrétion du volontaire (n° 62).

Pour la plupart des salariés, nous avons observé deux pics d’excrétion du 1-OHP et du 3-OHBaP. Pour le 1-OHP, le temps moyen d’apparition du premier pic est à 13 h ± 2,37, ce qui correspond à 5 heures après la fin de poste du premier jour de travail. Pour le deuxième pic, le temps moyen d’apparition est à 35 h ± 2,7, ce qui correspond à 5 h après la fin de poste du deuxième jour de travail.

Pour le 3-OHBaP, le temps moyen d’apparition du premier pic est à 17 h ± 3,5. Pour le deuxième pic, le temps moyen d’apparition est à 41 h ± 3,9. L’excrétion du 3- OHBaP est décalée dans le temps (~ 5 h) par rapport à celle du 1- OHP.

Mutagénicité urinaire

La mutagénicité urinaire est mesurée par la batterie de souches TA98S, YG1041S et YG1041. Les pouvoirs mutagènes (PM) des urines sont exprimés en rev/mg de créatinine. Les résultats sont présentés sous forme de deux courbes pour chaque individu : YG1041S et TA98S (voir figure 1B correspondant au volontaire sain N°62). Le prélèvement du début de poste représente le 2e échantillon pour tous les salariés, car le premier prélèvement (0 h) est effectué à domicile.

Les profils de mutagénicité sont différents pour chaque individu avec TA98S et YG1041S au niveau des temps d’apparition et des valeurs calculées d’activité. Pour chaque pic d’activité identifié, nous avons complété le test d’Ames avec la souche YG1041 pour poursuivre l’identification des mutagènes détectés. De plus, nous avons remarqué que les pics d’activité mutagène ne correspondent pas aux pics d’excrétion des deux métabolites urinaires et ne corrèlent pas avec les teneurs atmosphériques de Pyr et BaP.

Figure 1. Courbe de cinétique d’excrétion du 1-OHPyr, du 3-OHBaP (A) et, de l’activité mutagène sur YG1041S et TA98S (B).

Évaluations des taux d’adduits BPDE-ADN dans des cellules endobuccales

Le tableau 1 représente la mise en évidence des adduits BPDE-ADN dans les cellules endobuccales des salariés nos 70 à 75.

Pour le premier jour, le salarié n° 75 est absent, les moyennes des taux d’adduits varient de 6,5 UA ± 12,1 (73DP) à 30,0 UA ± 19,4 (70FP) et les médianes varient de 0,0 UA (73DP) à 23,8 UA (70FP). Les taux d’adduits BPDE-ADN mesurés pour les FP sont statistiquement supérieurs à ceux de DP pour tous les salariés.

Pour le second jour, les moyennes des taux d’adduits varient de 5,6 UA ± 6,0 (72DP) à 30,1 UA ± 17,6 (73FP) et les médianes varient de 12,2 UA (75FP) à 27,3 UA (73FP). Les taux d’adduits BPDEADN mesurés pour les FP sont statistiquement supérieurs à ceux de DP pour les salariés nos 70 à 74. Par contre, les taux d’adduits mesurés pour l’individu n° 75 sont similaires en DP et FP (P = 0,82).

Tableau 1. Comparaison des taux d’adduits entre début et fin de poste (DP et FP) du deuxième jour par le test W de Wilcoxon pour les salariés de n° 70 à 75. Les valeurs sont des unités arbitraires exprimant l’intensité lumineuse par pixel.
Témoin : cellules endobuccales prélevées chez un sujet non exposés; BPDE : cellules endobuccales prélevées chez un sujet non exposé et traitées in vitro par 40 μM Benzo[a]pyrène-trans-7,8-dihydrodiol-9,10-époxide (BPDE) pendant 1h; ET : écart type; NT : non testé ; DP : début de poste ; FP : fin de poste ; W test : comparaison entre les valeurs obtenues en DP et FP par le test W de Wilcoxon (test non paramétrique).

Conclusion

Plusieurs conclusions sur les deux biomarqueurs utilisés peuvent être tirées de cette étude cinétique.

Concernant le test d’Ames sur les urines de salariés :

  1. Difficulté à détecter des HAP dans les mélanges complexes. Cependant, les HAP sont les moins mutagènes;
  2. Pas de corrélation entre les métabolites urinaires et les HAP atmosphériques. Les pics de mutagénicité ont semblé être liés aux taux de particules atmosphériques et sont probablement dus à des mutagènes qui restent à identifier (Nikoyan et al., 2007);
  3. Possibilité de différencier la mutagénicité due aux HAP de celle des amines aromatiques (AA) et des nitroarènes (NA) avec la combinaison de souches TA98S, YG1041S et YG1041, et de différencier des AA et des NA d’origine environnementale et professionnelle.

Concernant la détection des adduits sur des cellules endobuccales :

  1. Mesure d’une exposition professionnelle aux HAP par inhalation;
  2. Détection spécifique des adduits BPDE-ADN;
  3. Prélèvement non invasif, technique facile à mettre en oeuvre et interprétation relativement simple: applicable à des études à grande échelle;
  4. Les taux d’adduits varient en fonction des taux de BaP atmosphériques, des protections respiratoires, des capacités de métabolisation et de réparation des adduits à l’ADN;
  5. Nécessité d’utiliser d’autres anticorps spécifiques antimétabolites des HAP.

Nos résultats posent la question de l’utilisation de la mutagenèse urinaire pour évaluer les expositions aux HAP et souligne l’utilité des adduits à l’ADN comme biomarqueurs d’exposition. Il serait utile de poursuivre ces travaux car les résultats observés avec le test d’Ames urinaire laissent présager l’implication d’autres mutagènes qui restent à identifier. De plus, il est nécessaire d’effectuer les études supplémentaires avec un nombre plus important d’individus pour valider l’utilisation des adduits comme biomarqueurs d’exposition dans les études de biomonitoring portant sur les HAP.

Bibliographie

  1. De Méo, M., Laget, M., Di Giorgio, C., Guiraud, H., Botta, A., Castegnaro, M., Duménil, G. (1996). Optimization of the Salmonella/mammalian microsome assay for urine mutagenesis by experimental designs. Mutation Res. 340, 51-65.
  2. Gendre, C., Lafontaine, M., Morele, Y., Payan, J.P., Simon, P. (2002). Relation between levels of 1-hydroxypyrene and 3- hydroxybenzo[a]pyrene for workers exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons. Polycyclic Aromatic Compounds 22, 761-769.
  3. Lafontaine, M., Payan, J.P., Delsaut, P., Morele, Y. (2000). Polycyclic aromatic hydrocarbon exposure in an artificial shooting target factory: assessment of 1- hydroxypyrene urinary excretion as a biological indicator of exposure. Ann. Occup. Hyg. 44, 89-100.
  4. Nikoyan, A., De Méo, M., Sari-Minodier, I., Chaspoul, F., Gallice, P., Botta, A. (2007). Evaluation of a battery of Salmonella tester strains for biomonitoring polycyclic aromatic hydrocarbons, nitroarènes and aromatic amines. Mutation Res. 626, 88- 101.
  5. Pavanello, S., Clonfero, E. (2000). Biological indicators of genotoxic, risk and metabolic polymorphisms. Mutation Res. 463, 285- 308.
  6. Simon, P., Lafontaine, M., Delsaut, P., Morele, Y., Nicot, T. (2000). Trace determination of urinary 3- hydroxybenzo[a]pyrene by automated column-switching high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 748, 337- 348.
  7. Yamasaki, E., Ames, B.N. (1977). Concentration of mutagens from urine by absorption with the nonpolar resin XAD-2: cigarette smokers have mutagenic urine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3555-3559.

Remerciements

Ce travail a été financé par des contrats de Plan Etat-Région et de la DRTEFP (N°93 CPQ 1002.0 et N°93 CA 2001 008.0). Il est dédié au Dr Vladimir Zabaloueff, trop tôt disparu.

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